Остановка "Гепатит С"
( Информация о гепатите С, диагностика гепатита С, лечение гепатита С, жизнь с гепатитом С...)

Вирус гепатита G, ВГG (Hepatitis G virus, HGV)



В свое время в зарубежной литературе, посвященной изучению гепатитов ни А-Е, основное внимание было уделено еще нерасшифрованным сывороточным гепатитам "ни B, ни C, ни D" с посттрансфузионным и другими путями передачи. Наиболее перспективными оказались исследования группы GB вирусов. Их наименование соответствует инициалам больного (John Barkett), 34-х летнего хирурга, заразившегося сывороточным гепатитом. Наблюдение относится к началу 60-х годов, поэтому контрольное обследование больного ограничивалось констатацией отсутствия у него HBsAg. В целях выявления вируса, кровь больного, взятую на 3-й день желтухи ввели тамаринам. Через 7-11 дней у них повысилось содержание АлАТ, что характеризовало цитолиз гепатоцитов и подтверждало развитие острого гепатита. Пассажи повторяли 6-кратно. У зараженных обезьян развился постинфекционный иммунитет, защищавший их от повторного заражения. Таким путем удалось доказать самостоятельность вируса, вызвавшего заражение.



В целях возможности проведения более глубокого исследования в будущем, кровь больного поместили в морозильную камеру в надежде на грядущие открытия и более совершенную методологию вирусологического поиска. Ретроспективные исследования крови GB были проведены спустя 30 лет в лаборатории Abbott. Был использован высокоинформативный метод PCR с последовательным “вычитанием” РНК вирусов разной природы, специально предназначенный для индикации РНК-вирусов. Этот метод, получил название репрезентативного дифференцированного анализа (РДА-ПЦР). С помощью этого метода из крови GB были выделены два самостоятельных вируса, получившие наименование GBV-A и GBV-B. Клонирование и анализ нуклеотидного состава вирусов GB позволили установить их принадлежность к флавивирусам. Они имели однонитевую РНК, близкую по характеристике к HCV, вместе с тем отличную от всех его генотипов. При заражении тамаринов острый гепатит с последующим развитием протективного иммунитета вызывал только GBV-B. Это позволило его рассматривать как причинный агент гепатита у данного вида обезьян. К GBV-A тамарины оказались невосприимчивы, что позволило отнести его к вирусам гепатита человека.

Использование той же техники исследования позволило, выделить из крови больных сывороточными гепатитами ни А-Е еще один вирус также семейства флавивирусов, филогенетически близкий к вирусам GB и поэтому получивший наименование GBV-C. По составу нуклеотидов и аминокислот этот вирус был близок к GBV-А, соответственно идентичных 59% нуклеотидов и 64% аминокислот, что определило правомерность объединяющего наименования GBV-A/С. Вместе с тем доля идентичных последовательностей аминокислот вирусов GBV-C и GBV-B была существенно меньшей – 30%.

К GBV-C оказался особенно близким еще один вирус, также из семейства флавивирусов. Первоначально он был выделен из крови больного хроническим гепатитом С и поначалу рассматривался как изолят HCV (вируса гепатита С). Однако его стали находить у больных получавших повторные переливания крови, а также у наркоманов и при отсутствии HCV. С начала 1995г. его стали именовать гепатитом G.

По характеристике нуклеотидов и аминокислот этот вирус – HGV почти совпадает с GBV-С. Доля одинаковых последовательностей составляет, соответственно 95% нуклеотидов и 85% аминокислот. Это позволило рассматривать HGV и GBV-C как изоляты одного вируса. Соответственно рекомендовано объединяющее наименование HGV.

Итогом исследований в лаборатории Abbott была разработка методики индикации GBV-C-РНК на основе ПЦР, представленной для проверки и накопления материалов 30 гепатологическим центрам, в разных регионах мира. Одновременно проводились широкие исследования по индикации HGV-РНК другими учеными, давшие по существу тождественные результаты. Это позволило получить достаточно большие материалы, характеризующие клинико-эпидемиологические особенности гепатита, вызванного HGV.

Таксономический анализ выявил принадлежность HGV к семейству флавивирусов (как и HCV). Дальнейшие исследования показали, что HGV представляет собой мелкий вирус с однонитевой линейной РНК. Геном вируса состоит из структурных и неструктурных белков, Структурные гены сосредоточены на 5’ конце, а неструктурные на 3’ конце. К неструктурной области относится РНК-зависимая РНК полимераза. Различают несколько субтипов HGV. 1а и 1б регистрируются в Африке, 2а и 2б в Америке и в Европе, 3 в Юго-Восточной Азии.

Геном вируса представлен одноцепочечной РНК с позитивной полярностью. По своей организации геном HCV подобен РНК HCV т. е. структурные гены расположены у 5' области генома, а неструктурные у 3' конца.

На обоих концах генома расположены нетранслируемые зоны. Протяженность РНК HCV, в различных изолятах вируса колеблется от 9103 до 9392 нуклеотидов. Одна открытая рамка считывания несет информацию о вирусспецифическом полипептиде, состоящем из 2873-2910 аминокислотных остатков. Сравнение последовательностей геномов GBV-A, GBV-B, GBV-C и HGV с HCV продемонстрировало, что их РНК не обладает более чем 32% идентичности, подтверждая тем самым постулат о самостоятельности этих вирусов.

Известно, что на 5' и 3' — нетранслируемых регионах вирусного генома имеются элементы, необходимые для регуляции жизнедеятельности вируса. Исследования по анализу последовательностей дали противоречивые результаты. Так, при клонировании крайних 5' последовательностей этих участков двух вирусных изолятов из Америки и одного из Западной Африки не удалось обнаружить такие элементы. Стартовый кодон (AUG) инициации вирусного полипротеина расположен в позиции 552 (нумерация по изоляту PNF2161) вблизи от начала Е1 региона РНК. Установлено, что происходящие в У — регионе вставки и выпадения нуклеиновых кислот сдвигают открытую рамку считывания РНК HGV, приводя к появлению дефектного “core” белка или возможно полного его отсутствия. Эти результаты позволили высказать предположение о использовании HGV капсидных белков других, возможно еще неоткрытых , вирусов или же клеточных белков, выполняющих в данном случае роль структурных полипротеинов. После определения полной последовательности нуклеиновых кислот РНК HGV оказалось, что в отличие от РНК HCV в Е1 и Е2 регионе отсутствует гипервариабельная область. Было высказано предположение об отсутствии главных генотипов. Существование же генотипов возможно на уровне суптипов и изолятов. Вопрос о генотипах GBV-C и HCV остается по-прежнему открытым, а опубликованные данные по анализу различных изолятов вируса противоречивы. Тем не менее высказывается предположение о наличии как минимум 3-х генотипов и нескольких субтипов вируса. По данным И. Мушавар с соавт., изоляты из Западной Африки относят к 1 генотипу, в котором выделяются два субтипа — 1а и 2b, в Европе и Северной Америке чаще удается выявить генотип 2а и 2b, а в Азии -3. Исследование генетической гетерогенности 354 нуклеотидного фрагмента 5'-нетранслируемого региона HGV, в 42 изолятах вируса из 14 стран (в том числе России), выявило два уровня геномной вариабельности:на уровне индивидуальной инфекции и уровне изолята.

Исследование неструктурного региона РНК ВГО и экспериментальное экспрессирование кодированных им белков определило наличие пяти белков (см. рис. 10), информация о которых находится в зонах NS2, NS3, NS4b, NS5a и NS5b.< Их вес находится в пределах от 20х103 до 70х103 дальтон. Эти белки выполняют функции: протеазы, хеликазы и РНК-зависимой РНК-полимеразы.

Представляют интерес данные, полученные при изучении плавучей плотности частиц ВГО в градиенте сахарозы до и после их обработки неионном детергентом — “Твин-80”, позволившие предположить наличие липидной оболочки у вируса. Ассоциация HGV с липидами может мешать взаимодействию с антителами во время персистенции вируса.

Основным маркером, применяемым для выявления вируса гепатита G, диагностики и изучения эпидемиологии гепатита G, является PHK-GBV-C/HGV, выявляемая методом амплификации с предварительным этапом обратной транскрипции (RT-PCR), при которой синтезируется кДНК. Для синтеза олигонуклеотидных праймеров использовали информацию о последовательностях участка РНК, кодирующего хеликазу (NS3). Этот выбор был сделан из-за высокой консервативности (83-99%) данного региона в различных изолятах вируса. Однако дальнейшие исследования выявили, что при тестировании некоторых образцов могут отмечаться ложнонегативные результаты, несмотря на наличие в них возбудителя. Учитывая это, для конструирования диагностикумов дополнительно стали использовать праймеры, информация о которых закодирована в 5' нетранслируемом регионе PHK-GBV-C/HGV.

В настоящее время фирмами “Boehringer Mannheim GmbH” (“Бёрингер Манхейм”) и “Abbott” (“ЭББОТТ”) выпускаются диагностикумы для выявления РНК — методом RT-PCR. В первом из них используются праймеры из 5'нетранслируемом и NS5a региона. Учет результатов проводится в ИФА с помощью биотин-авидинового комплекса. Диагностикум обладает высокой чувствительностью — 8х102. В диагностикуме фирмы “ЭББОТТ” применена лигазная технология проведения PCR (“Abbott Lex Probe System”). Оба диагностикума пока рекомендованы только для научных исследований. В большинстве лабораторий мира применяются самостоятельно изготовленные препараты, что определяет расхождение результатов тестирования. Проведенный во Франции внешний контроль качества исследований РНК GBV-C/HGV (21 лаборатория) выявил, что эти расхождения прежде всего определялись различиями в чувствительности применяемых препаратов (в 7 лабораториях чувствительность составляла 38-77%).

По аналогии с гепатитом С большие надежды связывали с выявлением антител к GBV-C/HGV. Основой для разработки диагностических препаратов стала информация о антигенных эпитопах, кодированных РНК GBV-C. В качестве вирусного антигена был использован оболочечный антиген Е2, возможно представляющий собой главную мишень для гуморального иммунитета. Участок РНК, кодирующий Е2 антиген, был клонирован и введен в клетки яичника китайского хомячка (СНО), которые продуцировали антиген. При помощи аффинной хроматографии проводили очистку Е2 антигена и использовали при конструировании ИФА-диагностикума, предназначенного для выявления анти-Е2. Исследование сывороток крови, полученных от больных гепатитом и здоровых лиц, выявило, что в подавляющем большинстве случаев позитивный результат обнаружения анти-Е2 был отмечен при отсутствии PHK-GBV-C/HGV. Эти данные свидетельствуют, что в отличие от гепатита С, выявление антител при гепатите G не может быть использовано для поиска вирусоносителей, а пригодно для регистрации уже прошедшей инфекции и проведения эпидемиологических исследований для оценки распространения инфекции в различных группах населения.





 

Реклама: